耐熱大腸菌群/糞大腸菌群快速檢測（酶底物法）

1  適用范圍

酶底物法適用于生活飲用水及其水源水、地表水、污水、廢水等水中糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）的定性檢測、定量檢測

2  方法原理

固定底物酶底物法（DST）采用大腸菌群細菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶分解ONPG使培養液呈黃色的原理，來(lái)判斷水樣中是否含糞大腸菌群（耐熱大腸菌群），糞大腸的培養溫度是44.5℃。

3  儀器設備

3.1 程控定量封口機（酶底物法程控定量封口機）

智能程控定量封口機是由智能電路電驅動(dòng)，內部專(zhuān)用加熱輥，專(zhuān)門(mén)用于51孔定量盤(pán)和 97 孔定量盤(pán)封膜作用，配合微生物檢測試劑使用，提供簡(jiǎn)單、快速、準確的定量檢測總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞（耐熱）大腸菌群、腸球菌和綠膿假單胞菌的實(shí)驗方案；51 孔定量盤(pán)和 97 孔定量盤(pán)是基于傳統方法ZUI大可能數 (MPN) 統計模型而設計的半自動(dòng)定量方法，可定量檢測出水樣結果，這種方法可以替代并優(yōu)于傳統（濾膜、及多管發(fā)酵）方法檢測水中微生物。

3.2電熱恒溫培養箱

3.3 冰箱

3.4 51孔定量盤(pán)、97孔定量盤(pán)

3.5 100ml無(wú)菌水樣瓶

3.6 高壓蒸汽滅菌鍋

3.7 干熱滅菌器

3.8 量筒

3.9 吸管

3.10 試管

4  培養基和試劑

4.1 科立得（固定底物技術(shù)酶底物法）檢測試劑：MMO-MUG培養基

4.2 無(wú)菌水

5  樣品的采集和保存

5.1采樣前準備：

5.1.1 采樣瓶：采用IDEXX公司科立得 系統配套的滅菌100毫升消毒帶刻度容器。

5.2 樣品采樣及注意事項

5.2.1將已滅菌和封包好的采樣瓶，無(wú)論在什么條件下采樣時(shí)，均要小心開(kāi)啟包封紙和瓶蓋，避免瓶蓋及瓶子頸部受雜菌污染，并注意在使用船只或附帶的采樣繩等附加設備采樣時(shí)可能造成的污染。

5.2.2 在采集江、河、湖、庫、地表水樣時(shí)，可握住瓶子底部直接將采樣瓶插入水中，約距水面10~15厘米處，瓶口朝來(lái)水方向，使水樣灌入瓶?jì)?。如果沒(méi)有水流，可握住瓶子水平前推，直至充滿(mǎn)水樣為止。采好樣后，迅速蓋上瓶蓋和包裝紙。采樣后，采樣瓶?jì)壬喜繎粲幸恍┛障?，以便檢驗前充分混勻水樣。

5.2.3 用采樣器采樣時(shí)，將無(wú)菌的水樣瓶放入架內。將采樣裝置放入水中。到達預定深度后，打開(kāi)瓶塞，待水樣灌好后，松開(kāi)瓶塞的軟繩，蓋上瓶蓋。再將整個(gè)裝置提出水面。

5.2.4 從自來(lái)水龍頭采集樣品時(shí)，不要選用漏水的龍頭，采水前可先將水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌或用70%的酒精溶液消毒水龍頭及采樣瓶口，然后將水龍頭完全打開(kāi)，放水數分鐘后除去水管中的滯留雜質(zhì)。采水時(shí)控制水流速度小心接入瓶?jì)取?span lang="EN-US">

5.2.5在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應自上向下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾；同一采樣點(diǎn)與理化監測項目同時(shí)采樣時(shí)，應先采集細菌等檢驗樣品，否則樣品可能被污染，采樣前，不得用水樣刷洗采樣瓶。

5.2.6采樣完畢，應將采樣瓶編號、作好采樣記錄。將記錄下采樣條件，填入采樣表格內。

5.2.7 樣品的運輸和保存

采好的水樣，應迅速運往實(shí)驗室，進(jìn)行細菌學(xué)檢驗，一般從取樣到檢驗不宜超過(guò)2小時(shí)，不然應使用10℃以下的冷藏設備保存樣品，但不得超過(guò)6小時(shí)，實(shí)驗室接到送檢樣后，應將樣品立即放入冰箱，并在2小時(shí)內著(zhù)手檢驗。如果因路途遙遠，送檢時(shí)間超過(guò)6小時(shí)者，則應考慮現場(chǎng)檢驗。

5.3 樣品交接

樣品運回實(shí)驗室后，由采樣人員與質(zhì)管科樣品管理人員進(jìn)行交接。雙方需對樣品名稱(chēng)、編號、樣品采集點(diǎn)名稱(chēng)、采樣時(shí)間、數量、采樣人簽名等進(jìn)行登記核實(shí)。如在驗收過(guò)程中，發(fā)現編號錯亂、字跡不清、規格不符、監測項目不明及采樣不合要求者，可拒收并建議補采。如無(wú)法補采，應經(jīng)領(lǐng)導批準，方可收樣測定。樣品管理人員收樣后應盡快轉交檢測人員以便及時(shí)進(jìn)行分析。

5.4干擾與消除：防止操作過(guò)程中的污染，嚴格無(wú)菌操作。

6  操作步驟

6.1 水樣稀釋

檢測所需水樣為100mL。若水樣污染嚴重，可對水樣進(jìn)行稀釋。取10 mL水樣加入到90 mL無(wú)菌水中，必要時(shí)可加大稀釋度，水樣按照10倍逐級稀釋。

6.2 定性反應

用100 mL的無(wú)菌稀釋瓶量取100 mL水樣，加入科立得培養基粉末，混搖均勻使之完全溶解后，放入44.5℃的培養箱內培養24h。

6.3 51孔定量盤(pán)法

6.3.1 用100 mL的無(wú)菌稀釋瓶量取100 mL水樣，加入科立得培養基粉末，混搖均勻使之完全溶解。

6.3.2 將前述100mL水樣全部倒入51孔無(wú)菌定量盤(pán)內，以手撫平定量盤(pán)背面以趕除孔穴內氣泡，然后用程控定量封口機封口。放入44.5℃的培養箱內培養24h。

6.3.3 無(wú)需稀釋檢測范圍：1-200MPN/100mL糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）

6.4 97孔定量盤(pán)法

6.4.1 將100mL水樣全部倒入97孔無(wú)菌定量盤(pán)內，其余步驟與6.3.1、6.3.2條款相同。

6.4.2 無(wú)需稀釋檢測范圍：1-2419MPN/100mL糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）

7  結果報告

7.1 結果觀(guān)察與報告

7.1.1 結果判讀

將水樣培養24h后進(jìn)行結果判讀，如果結果為可疑陽(yáng)性，可延長(cháng)培養時(shí)間到28h進(jìn)行結果判讀，超過(guò)28h之后出現的顏色反應不作為陽(yáng)性結果。

7.1.2 定性反應

水樣經(jīng)24h培養之后如果顏色變成黃色，判斷為陽(yáng)性反應，表示水中含有糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）。水樣顏色未發(fā)生變化，判斷為陰性反應。定性反應結果以糞大腸菌群檢出或未檢出報告。

7.1.3   51孔定量盤(pán)法、97孔定量盤(pán)法

7.1.3.1 將培養24h的水樣的定量盤(pán)取出觀(guān)察，如果顏色變成黃色則表示定量盤(pán)孔中含有糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）。若無(wú)法明顯辨別黃色孔格，則可借助97孔陽(yáng)性比色盤(pán)比色判讀。檢測結果說(shuō)明如下：

7.1.3.2 計算有陽(yáng)性反應的孔穴數，對照附表1：51孔定量盤(pán)MPN表或者附表2：97孔定量盤(pán)MPN表查出代表的糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）最可能數。結果以MPN/100mL表示。如所有孔未產(chǎn)生黃色，則可報告為糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）未檢出。

7.1.3.3 在無(wú)需稀釋檢測范圍內直接可讀出結果。若水中糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）污染嚴重，超出定量范圍（全部孔格顯黃色）則需要稀釋?zhuān)x取結果后再乘以稀釋倍數。

8  質(zhì)控

每批科立得試劑需做驗證檢驗：向一份100mL無(wú)菌水樣中接種含有糞大腸菌的質(zhì)控樣標準菌株，按照上述定量檢測步驟操作觀(guān)察結果，看結果是否在其范圍內。

9  注意事項

9.1 如果水樣品有背景顏色，需做一個(gè)空白試驗，與科立得標準檢測結果相比較。

9.2 只可使用滅菌水，不含緩沖液的水，不含氧化劑的水進(jìn)行樣品稀釋。

9.3 此法所用試劑只用于常規水樣，不可用于濃縮水樣。

9.4 如水樣中含有過(guò)多的氯，則加入科立得試劑可能顯藍光，則該水樣不可用此方法。

9.5 此法無(wú)需在無(wú)菌室中進(jìn)行，但操作過(guò)程因避免微生物污染。

9.6 檢測使用過(guò)的定量盤(pán)應滅菌后棄去。把約30個(gè)定量盤(pán)放入防爆袋中，用繩子松松的扎住袋口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃高壓滅菌20min后取出，在防爆袋上注明“生物垃圾已滅菌”方可棄去。

附表1：51孔定量盤(pán)MPN表

附表2：97孔定量盤(pán)MPN表